Pegagan merupakan tanaman obat yang cukup dikenal luas di kalangan dunia. Pegagan memiliki bahan aktif, antara lain : alkaloid, saponin, tanin, flavonoid, steroid, triterpenoid dan glikosida. Senyawa flavonoid diasumsikan mempunyai aktivitas antioksidan dan antibakteri (Hanani, 2015). Kebutuhan simplisia pegagan dalam industri jamu menjangkau 126 ton setiap tahun dan menempati urutan ke-13 dari 152 jenis simplisia (Sutardi, 2016). Kendala utama dalam penggunaaan senyawa aktif pegagan adalah ketersediaan bahan baku yang terbatas di alam, alternatif untuk mengatasi permasalahan tersebut dengan metode kultur jaringan (Anwar & Isda, 2020). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh jenis dan konsentrasi auksin terbaik terhadap pembentukan kalus daun pegagan (Centella asiatica L.) secara in vitro. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 9 perlakuan, yaitu: kontrol, NAA 0,25 ppm (N1), NAA 0,50 ppm (N2), NAA 0,75 ppm (N3), NAA 1 ppm (N4), 2,4-D 0,25 ppm (D1), 2,4-D 0,50 ppm (D2), 2,4-D 0,75 ppm (D3), dan 2,4-D 1 ppm (D4) diulang sebanyak 3 kali, dan setiap unit 5 sampel. Data hasil pengamatan waktu muncul kalus, dan persentase pembentukan kalus di analisis dengan uji ANOVA, sedangkan warna dan tekstur kalus di analisis deskriptif. Hasil penelitian menunjukan bahwa konsentrasi terbaik untuk menginisiasi pembentukan kalus eksplan daun pegagan yakni pada perlakuan 2,4-D 0,75 ppm (D3) dengan waktu muncul kalus 14.71±0.30 hari dengan warna kalus hijau dan tekstur kalus kompak (compact). Sedangkan persentase pembentukan kalus tertinggi berada pada perlakuan NAA 0,50 ppm (N2) dengan persentase pembentukan kalus sebesar 93.33±11.54% dengan warna kalus hijau kekuningan dan tekstur kalus remah (friabel).