Depot air minum adalah suatu usaha yang melakukan proses pengolahan air baku menjadi air minum dan menjual langsung kepada konsumen. Banyak usaha depot air minum isi ulang di Kecamatan Kemangkon. Hygiene sanitasi merupakan usaha yang dilakukan untuk mengendalikan faktor penyebab terjadinya pencemaran yang dapat menimbulkan penyakit atau gangguan kesehatan lainnya. Standar kandungan Escherichia coli dan dalam air minum yaitu 0 per 100ml sampel. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan hygiene sanitasi dengan keberadaan bakteri Escherichia coli pada air minum isi ulang di Kecamatan Kemangkon. Penelitian dilakukan secara observasional analitik. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2022. 11 depot air minum isi ulang digunakan sebagai sampel dengan menggunakan teknik simple random sampling. Instrumen yang digunakan untuk memeriksa keberadaan bakteri Escherichia coli dengan metode Most Probable Number (MPN), sedangkan untuk variabel sanitasi tempat, sanitasi peralatan dan hygiene penjamah dengan observasi dan wawancara. Data dianalisis dengan uji fisher exact test. Hasil penelitian menunjukkan tidak terdapat hubungan antara sanitasi tempat dengan keberadaan bakteri Escherichia coli (p value = 0.273), tidak terdapat hubungan sanitasi peralatan dengan keberadaan bakteri Escherichia coli (p value = 0.091), dan tidak terdapat hubungan hygiene penjamah dengan keberadaan bakteri Escherichia coli (p value = 1.000). Tidak ada hubungan hygiene sanitasi dengan keberadaan bakteri Escherichia coli pada depot air minum isi ulang di Kecamatan Kemangkon.