Putri malu (Mimosa pudica Linn.) merupakan salah satu tanaman yang terdapat di Indonesia. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak dan fraksi metanol-air daun putri malu memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan pemisahan fraksi metanol-air daun putri malu dan di uji aktivitas antibakteri dari hasil pemisahannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari subfraksi-subfraksi hasil pemisahan fraksi metanol-air daun putri malu menggunakan kromatografi kolom terhadap Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Staphylococcus aureus. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol:air (70:30), fraksinasi menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat, dan dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan kromatografi kolom. Uji aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi agar. Hasil uji aktivitas antibakteri subfraksi-subfraksi hasil pemisahan fraksi metanol-air daun putri malu menunjukkan bahwa subfraksi-subfraksi tersebut tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri P. aeruginosa, E. coli, B. subtilis, dan S. aureus.